Secuenciación de amplicones y metagenómica

Pescando ADN en el océano: Diferencias entre la secuenciación metagenómica de Escopeta y la secuenciación de amplicones

Imagina una muestra de suelo como un gran océano lleno de ADN, y a un genetista microbiano como un pescador de ADN que intenta capturar y comprender los organismos que viven en ese suelo. Al igual que existen diferentes técnicas para pescar en el océano, los científicos disponen de varios métodos para estudiar el ADN de los microbios del suelo. 

Si conoces estas técnicas, podrás determinar qué método es el más adecuado para tu objetivo de investigación. En este artículo analizaremos las principales diferencias entre la metagenómica de escopeta y la secuenciación de amplicones.

Enfoques genéticos moleculares: Red de arrastre frente a anzuelo

Metagenómica de escopeta: La red de arrastre de ADN

La metagenómica de escopeta puede equipararse a una red de pesca de ADN que atrapa y secuencia todos los tipos de ADN existentes en una muestra de tierra. Permite la detección de una amplia gama de organismos, incluidos animales, plantas, nematodos, virus, bacterias y hongos, todo ello en un único análisis.

Secuenciación de amplicones: La supercaña de pescar con anzuelos

Por el contrario, las soluciones de secuenciación de amplicones pueden visualizarse como una supercaña de pescar equipada con millones de anzuelos, cada uno de ellos diseñado para dirigirse a grupos específicos de especies. Este enfoque permite a los investigadores pescar selectivamente las especies de interés. Por ejemplo, el anzuelo 16S está diseñado para capturar bacterias y arqueas, mientras que el anzuelo ITS está especializado en hongos.

Con estos dos métodos, los científicos pueden emplear la red de arrastre de ADN de la metagenómica de escopeta para obtener una visión general del contenido genético de una muestra, o pueden utilizar el método de anzuelo dirigido de la secuenciación de amplicones para centrarse en grupos específicos de organismos, en función de sus objetivos de investigación y de la profundidad de la información requerida.

Ventajas y desventajas

Utilizar una u otra metodología tiene varias ventajas y desventajas. En este artículo mostraremos las diferencias básicas.

1. Perfiles de especies: Tamaño de la red de arrastre frente a anzuelos

En la vasta extensión del océano se puede encontrar una gran variedad de especies, desde ballenas y delfines hasta peces, cangrejos, almejas y plancton. Del mismo modo, la metagenómica de escopeta tiene la capacidad de capturar una amplia gama de ADN en una muestra, de forma similar a como una red de arrastre puede capturar diversos organismos marinos.

Sin embargo, es importante señalar que la noción de capturar "todo" el ADN puede no ser tu objetivo. El alcance de la cobertura en la metagenómica de escopeta depende del tamaño de la red de arrastre empleada.

El tamaño de la red es crucial, ya que utilizar una red más pequeña que el tamaño de una ballena impediría por completo la captura de ballenas. En cambio, esta limitación no se aplica cuando se utilizan anzuelos. Con el anzuelo adecuado, es posible capturar una ballena si se es pescador (o una bacteria si se es genetista microbiano).

Como especialista en microbioma, mi trabajo se centra en discernir qué organismos prosperan en cada entorno en función de sus interacciones y su composición genética.

Los microbios, en comparación con las ballenas, tienen una representación significativamente mayor en el océano. Mientras que en el océano hay aproximadamente 1,5 millones de ballenas, en sólo 2 mililitros de agua oceánica se puede encontrar un número equivalente de microbios. Debido a la abundancia de bacterias, cuando se emplea una red de arrastre que no puede cubrir la totalidad del océano, la probabilidad de capturar microbios es considerablemente mayor que la de capturar una ballena.

En el suelo, se observa un patrón similar. Las células bacterianas superan en número a las fúngicas en un factor de 100 a 10.000. En consecuencia, cuando se emplea la secuenciación de Escopeta (shotgun), la probabilidad de secuenciar un mayor número de bacterias es significativamente mayor que la de hongos debido a esta disparidad numérica.

Sin embargo, cuando se utiliza la secuenciación de amplicones con un anzuelo ITS específico en la metabarcodificación, la interferencia de las bacterias se reduce al mínimo, ya que el objetivo está orientado específicamente a la captura de hongos. Este enfoque específico permite un análisis más preciso y centrado de las poblaciones fúngicas sin verse influido por la presencia de bacterias.

Cuando se considera el contexto genómico, es crucial asegurarse de que el tamaño de la red de arrastre, que representa la profundidad de secuenciación, es significativamente mayor que el número de anzuelos objetivo o de lecturas de secuenciación/ADN obtenidas por muestra. Idealmente, el tamaño de la red de arrastre debería ser al menos de 100 a 10.000 veces mayor que el número de anzuelos para lograr una representación completa.

Sin embargo, es importante tener en cuenta que incluso con una red de arrastre de mayor tamaño, la representación total de especies dentro de una muestra puede seguir siendo limitada. Normalmente, sólo las especies más abundantes y las que tienen genomas más grandes están bien representadas en los datos de secuenciación.

Esto puede suponer un reto a la hora de estudiar especies que desempeñan un papel crucial en los agroecosistemas pero que existen en escaso número. Su escasa representación en los datos de secuenciación puede ocultar su importancia e impacto en el ecosistema. Por lo tanto, los investigadores deben tener muy en cuenta las limitaciones y los sesgos asociados a la profundidad de la secuenciación para garantizar una comprensión exhaustiva de las comunidades microbianas y sus funciones, sobre todo cuando se investigan especies clave que pueden tener una influencia significativa en los agroecosistemas.

"Tamaño de la especie" en el contexto genómico es el tamaño genómico. Los organismos multicelulares (eucariotas) son como los grandes animales del océano, su tamaño genómico es 10000-100.000 veces mayor que el genoma de una bacteria.

2. Estimación de funciones: Desvelar las funciones del ecosistema mediante métodos de pesca

Tanto el método de pesca con red de arrastre como el de pesca con anzuelo y ADN proporcionan datos que permiten evaluar la funcionalidad potencial de las especies capturadas y sus funciones dentro del ecosistema.

Las enzimas, que impulsan diversas funciones biológicas, están codificadas en el ADN. El método de la red de arrastre (secuenciación de escopeta) permite capturar el ADN genómico, lo que posibilita la secuenciación completa de especies con gran abundancia y genomas de tamaño moderado. Esta secuenciación exhaustiva facilita la identificación de una parte significativa del código genético enzimático.

Sin embargo, es importante reconocer que los genomas capturados representan sólo una fracción de las especies presentes en el suelo o en el océano, a menos que se utilice una red excepcionalmente grande, lo que puede resultar prohibitivo desde el punto de vista de los costes.

En el caso de las especies restantes, sólo se capturan fragmentos de sus genomas, lo que da lugar a una identificación variable de las funciones. El alcance de la identificación de funciones depende de factores como la abundancia de especies y el tamaño del genoma.

No todas las funciones tienen el mismo interés. 

No todas las funciones tienen el mismo interés o relevancia en un contexto determinado. Por un lado, el abanico potencial de dianas enzimáticas es enorme, abarcando miles de enzimas potenciales incluso sólo dentro del reino bacteriano. Comprender qué dianas enzimáticas específicas son de interés en relación con el crecimiento de las plantas se convierte en un factor crucial.

Sin embargo, en comparación con las bacterias, los conocimientos disponibles sobre posibles enzimas relacionadas con el crecimiento vegetal son relativamente limitados para otros grupos taxonómicos como plantas, animales y hongos. En consecuencia, muchas secuencias capturadas pueden carecer de la capacidad de proporcionar información taxonómica o funcional específicamente relevante para la agricultura.

Es esencial no sólo identificar el número total de funciones presentes, sino también evaluar su representación dentro de una muestra. Este conocimiento nos permite discernir la abundancia relativa de funciones específicas y vincularlas a los fenotipos correspondientes, como una mayor liberación de nitrógeno o una mayor producción de fitohormonas.

Es importante reconocer que los sesgos derivados del tamaño de la red de arrastre pueden afectar a los datos obtenidos. Esto puede provocar ruido en forma de secuencias de ADN sin utilidad, lo que se traduce en dificultades para identificar funciones poco abundantes y en la posible sobrerrepresentación de determinadas funciones. Por lo tanto, es necesario considerar y evaluar cuidadosamente estos factores para evitar interpretaciones erróneas y garantizar una comprensión exhaustiva del potencial funcional dentro de una comunidad microbiana.

En lo que respecta a los anzuelos (en referencia a la secuenciación de amplicones), existen dos enfoques para comprender la funcionalidad. Uno de ellos consiste en diseñar anzuelos para captar funciones génicas específicas, como las enzimas relacionadas con los procesos del nitrógeno (N). Este enfoque permite una selección precisa, independientemente de la abundancia de especies. Otro enfoque interesante consiste en utilizar la inteligencia artificial (IA) y los conocimientos científicos existentes para identificar las funciones.

Biome Makers revoluciona el análisis del microbioma del suelo con su tecnología patentada BeCrop, que integra genómica, redes microbianas y aprendizaje automático. A diferencia de otros enfoques que se concentran en la metagenómica de especies específicas, BeCrop emplea secuenciación de amplicones, análisis ecológico avanzado y algoritmos de aprendizaje automático.

Aprovechando décadas de investigación acumulada y la mayor base de datos taxonómica mundial, BeCrop predice y desvela las intrincadas funciones e interacciones de todo el microbioma del suelo. Este enfoque integral ofrece una comprensión más profunda de la dinámica ecológica en juego dentro del microbioma del suelo.

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Para ilustrarlo, imaginemos que capturamos distintas especies de peces. Consultando la información registrada previamente por otros pescadores, que han descrito las funciones de esas especies de peces en un libro, podemos comprender sus funciones. En esta analogía, cada secuencia de ADN capturada representa una especie sobre cuya función ya existe información. Por lo tanto, si se dispone de información sobre la función de una especie, sigue siendo la misma para cada individuo de esa especie.

Tanto los métodos de ADN con redes de arrastre como con anzuelos permiten descubrir nuevas especies, de forma muy parecida a los enfoques metagenómicos en genómica. Por ejemplo, si se captura una nueva especie de tiburón, puede ser raro y difícil identificar toda su gama de funciones utilizando únicamente el método de la red de arrastre. Sin embargo, con el enfoque del anzuelo, podemos observar similitudes entre la nueva especie y otras especies de tiburones conocidas que comparten ciertas funciones. Aquí es donde la IA desempeña un papel crucial.

3. Eficiencia de costes: Esfuerzos pesqueros

Tanto el método de la red de arrastre como el de los anzuelos requieren distintos niveles de gasto energético. En general, los anzuelos requieren menos energía que las redes de arrastre.

Hay tres razones principales para ello:

• Se necesita una red de arrastre grande: Para capturar todas las especies representadas y maximizar el número de funciones en una muestra de suelo, se necesita una gran red de arrastre. Esto suele requerir entre 100 millones y 10.000 millones de lecturas de secuenciación de ADN, lo que supera la capacidad de pesqueros populares como el Illumina Miseq, que solo puede manejar 20 millones de lecturas. En consecuencia, a menudo se necesitan secuenciadores de ADN más avanzados y caros, como NextSeq o Hiseq. Los barcos de pesca más grandes también conllevan costes más elevados y un mayor consumo de combustible.
• Esfuerzo computacional: El esfuerzo va más allá de la pesca, ya que también son necesarias la clasificación, la comparación y el almacenamiento. Debido a la mayor cantidad y complejidad de los datos generados, el esfuerzo computacional suele ser mayor con el método de la red de arrastre. Tratar con conjuntos de datos tan grandes requiere una optimización en el procesamiento de los datos, por lo que se trata de una consideración importante.
• Energía: El método de la red de arrastre consume una cantidad significativa de energía al incluir ADN no útil o irrelevante, lo que conduce a un uso ineficiente de la energía y a un posible ruido en la clasificación de los datos.
  
  

Teniendo en cuenta estos factores, ambos enfoques tienen sus propias ventajas e inconvenientes en función de la pregunta de investigación y el diseño del estudio. Los investigadores deben considerar detenidamente los puntos fuertes y las limitaciones de cada método a la hora de seleccionar el enfoque más adecuado.

Sin embargo, si eres un amante de los peces que busca la mejor técnica de pesca con ADN, puedes confiar en la experiencia de Biome Makers. Nuestros expertos garantizarán una experiencia de pesca ideal para proporcionar los mejores peces que satisfagan tus expectativas culinarias o intereses de investigación. Estamos especializados en técnicas de pesca por ADN eficaces, equilibradas y sin esfuerzo, manteniendo el máximo respeto por las especies oceánicas. ¡Eso es exactamente lo que ofrece BeCrop!

Una nota final: Aunque el suelo es importante y merece nuestra protección, extender el mismo nivel de cuidado y preocupación a nuestros océanos es igualmente crucial.